2020
20.1
Einfluss einer SARS-Cov-2 Infektion auf die Hämatopoese und das Immunprofil von Patienten
mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS)
Prof. Dr. med. Wolf-Karsten Hofmann, Prof. Dr. med. Daniel Nowak, III. Med. Klinik
Universitätsmedizin Mannheim, Hämatologie und Onkologie, Theodor-Kutzer-Ufer 1-3,
68167 Mannheim
Patienten mit myelodysplastischem Syndrom (MDS) sind durch eine sowohl quantitativ als qualitativ schwer gestörte Hämatopoese gekennzeichnet. Dies zeigt sich insbesondere in einer ineffektiven Erythropoese (Bildung von reifen Erythrozyten), was in mehr als 90 % der Patienten zu einer regelmäßigen Transfusion von Erythrozyten-Konzentraten führt. Weiterhin hoch krankhaft verändert sind sowohl die Thrombopoese (Bildung der Blutplättchen) als auch die Granulopoese (Bildung der Abwehrzellen). Weiterhin ist die Anzahl und Funktion immunkompetenter Abwehrzellen stark eingeschränkt.
Patienten mit MDS bedürfen einer spezialisierten und sehr komplexen regelmäßigen Betreuung an einem universitären Zentrum, welche eine umfangreiche Diagnostik und eine Behandlung mit ausgewählten krankheitsspezifischen Medikamenten umfasst. Die Erfolge, die in den letzten 15 Jahren bei der Betreuung dieser Patienten zu verzeichnen sind, sind im Wesentlichen auf die translationale Forschung (translationale Forschung hat die Aufgabe, Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in präklinische Entwicklungsprogramme und anschließend in die Klinik zu übertragen) zurückzuführen. Neue Ansätze zur Prävention, Diagnostik und Therapie auf dem Gebiet der myelodysplastischen Syndrome gelangen zunächst im Rahmen von klinischen Studien in die medizinische Praxis.
Im Zusammenhang mit der aktuelle COVID-19 Pandemie (Coronavirus) wurde insbesondere in der Hämatologie beobachtet, dass Patienten, die an einer hämatologischen Grunderkrankung leiden und sich mit SARS-CoV-2 infizieren, häufig einen raschen, fatalen und fortschreitend schweren Krankheitsverlauf verzeichnen. Sie stellen eine besondere Risikogruppe hinsichtlich der Anfälligkeit der Hämatopoese dar.
Daher ist es einerseits eine Herausforderung, diese Patienten besonders vor einer Infektion mit SARS-CoV-2 zu schützen. Andererseits ist es unabdingbar, bei infizierten Patienten Erkenntnisse über den Einfluss der Infektion auf die im Rahmen der hämatologischen Grund-erkrankung gestörte Hämatopoese zu gewinnen.
Das Ziel dieser weltweit ersten
Untersuchungen bei Patienten mit MDS, die an einer COVID-19 Erkrankung
leiden, ist es, durch entsprechende MDS-spezifische in vitro- und in
vivo-Anlaysen die Auswirkungen der COVID-19 Infektion auf die
Blutbildung und das Immunsystem zu untersuchen.
siehe Veröffentlichung:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10550045/
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20.2
Entzifferung der klonalen Heterogenität in der Akuten myeloischen Leukämie mit Translokation (8;21) durch Einzel-Zell Sequenzierung
PD Dr. Frederik Damm, Charité, Campus Virchow, Hämatologie und Tumorimmunologie
Augustenburger Platz 1, 13353 Berlin
Die Chromosomenmutation t(8;21) zählt mit einem Anteil von 5-12% zu den häufigsten strukturellen Chromosomenanomalien der akuten myeloischen Leukämie. Sie führt zu dem Transfusionsgen RUNX1-RUNX1T1 (bzw. AML1-ETO)
Die Expression von RUNX1-RUNX1T1 - beziehungsweise CBFB-MYH11 – Fusionsproteinen führt zwar zu einer fehlerhaften Zellbildung, genügt jedoch allein nicht zur Leukämogenese. Zusätzliche molekulargenetische Mutationen sind notwendig. Es gibt Gemeinsamkeiten unter den CBF-AML wie der klinische Verlauf nach Erstdiagnose und eine vergleichsweise günstige Prognose.
Im Auftreten additiver genetischer Veränderungen treten jedoch erhebliche Unterschiede zu Tage, die die klinische Heterogenität (Stoffgemisch von uneinheitlichen Elementen, die sich nicht vermischen) nicht nur der CBF-Leukämien sondern auch der AML mit t(8;21) widerspiegeln.
So konnten wir vor kurzem zeigen, dass in mehr als 95% aller t(8;21) AML-Patienten zusätzliche krankheitstreibende Genaberrationen detektiert werden können. Bemerkenswert war die Beobachtung, dass sich einige dieser Mutationen nach Erreichen einer kompletten Remission anhaltend nachweisen ließen Diese Mutations-Persistenz scheint mit einer erhöhten Rezidiv-Wahrscheinlichkeit und verkürztem Gesamtüberleben vergesellschaftet zu sein. Die genauen molekularen Mechanismen, wie die persistierenden (verharrenden) Mutationen zur klonalen Evolution und der Rezidiventwicklung beitragen, bleiben jedoch weitestgehend unverstanden.
Das hier vorgestellte Projekt strebt an, die klonale Komposition und die dynamische Entwicklung der zahlreichen Subklone während des Krankheitsverlaufs auf Einzel-Zell Ebene zu entschlüsseln. Hierzu sollen 10 AML Patienten mit t(8;21) zu drei Zeitpunkten untersucht werden: Erstdiagnose, komplette Remission und Rezidiv.
Das übergeordnete Projektziel stellt somit die Entzifferung von Rezidivmechanismen dar, um zukünftig individuellere Therapien und/ oder erweiterte molekulare Nachsorgetechniken zu entwickeln, denn bis dato werden nur 50% der intensiv therapierten AML-Patienten mit t(8;21) von ihrer Erkrankung geheilt.
Diese Untersuchungen werden somit erstmalig die Phylogenie (Stammesgeschichte) dieser AML Entität entschlüsseln als auch neue Ansätze für ein besseres Verständnis der Rezidiv-Entwicklung liefern.
Die Identifikation der exakten genetischen Zusammensetzung der verschiedenen Subklone mittels Einzelzell-Sequenzierung ist demnach von entscheidendem wissenschaftlichem und klinischem Interesse. Das Verständnis darüber, welche Mutationen in einem bestimmten Subklon zusammenwirken, um dessen Aggressivität zu verstärken, oder welche sich gegenseitig ausschließen, wird breite Anwendungen in der Klinik haben, zum Beispiel in Bezug auf Auswahl und zeitliche Abfolge weiterer Therapieschemata. Aus diesem Grund sollte dieser Ansatz als erster Schritt hin zu einer präziseren und dynamischeren Risikostratifizierung (dem Abschätzen des Risikos, mit dem eine Erkrankung fortschreitet, zu Komplikationen oder zum Tod führt ) von Krankheiten mit hochvariablem klinischen Verlauf verstanden werden. Die frühe Erkennung aggressiver, Transformations-induzierender Subklone kann als frühzeitiges Warnsystem im zukünftigen klinischen Therapiegeschehen dienen.
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20.3
Optimierung der CAR-NK-Zell-Therapie zur Behandlung der Akuten Myeloischen Leukämie
Prof. Dr. med. Evelyn Ullrich, Leitung Experimentelle Immunologie, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin,
Univsitätsklinikum, Theodor-Stern-Kai 7, 60590 Frankfurt am Main
Bei älteren
Menschen ist die Therapie der Akuten Myeloischen Leukämie dadurch
erschwert, dass die erforderliche hochdosierte Chemotherapie mit
nachfolgender Stammzelltransplantation eine hohe therapieassoziierte
Mortalität aufweist. Es gibt dringenden Bedarf neuer
Behandlungsstrategien.
Ein gut verträgliches AML-Therapiekonzept ist der adoptive Transfer
von Natürlichen Killer (NK)-Zellen, die Teil des
angeborenen Immunsystems sind. Sie sind in der Lage, entartete
Leukämiezellen zu erkennen und zu töten.
Es gelang uns bereits, NK-zellen genetisch zu
modifizieren, so dass AML-spezifische chimäre Antigenrezeptoren (CARs)
auf den NK-Zellen exprimiert werden.
Im nächsten Schritt sollen CD33-CAR-NK-Zellen gegen zur Behandlung der Akuten Myeloischen Leukämie in einem Xenograft-NSG-Modell sowie gegen vom Patienten gewonnene AML-Zellen geprüft werden.
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20.4
Analyse der leukämogenen Eigenschaften der FLT3-ITD-TKD Mutante Leukämie
Prof. Dr. med. Zhixiong Li, Professor Dr.med. Arnold Ganser, Medizinische Hochschule Hannover, Carl-Neuberg-Str.1, 30625 Hannover
Proteintyrosinkinasen (PTKs) (Teil von Rezeptorsystemen, die einen Beitrag zur Signalübertragung leisten) spielen eine wichtige Rolle bei der malignen Transformation von Zellen.
Aktivierende Mutationen in FLT3 wurden bei ungefähr 30% der AML (akute myeloische Leukämie)-Patienten identifiziert, was es zu einer der häufigsten Mutationen mit prognostischen Auswirkungen macht, die bei dieser Krankheit beobachtet werden. Jedoch zeigten zielgerichtete Monotherapien für AML-Patienten mit FLT3-ITD (Interne Tandem-Duplikation)-Mutationen nur mäßige Wirksamkeit.
Die kürzlich veröffentlichte multiinstitutionelle RATIFY-Studie zeigte eine statistisch signifikante Verbesserung des Gesamtüberlebens von FLT3 + AML-Patienten, die mit Midostaurin (gegen FLT3)
und Chemotherapie behandelt wurden. Eine vorteilhafte Wirkung von Midostaurin schien jedoch
in der NPM1wt / FLT3-ITDlow-Gruppe am ausgeprägtesten zu sein. Resistenz gegen FLT3-
Inhibitoren kann z.B. durch Punktmutationen in FLT3 auftreten, z. B. Mutationen innerhalb der
Aktivierungsschleife D835 und Y842. Die sogenannte doppelmutante FLT3-ITD-TKD (Tyrosine kinase domain mutation) spielt bei der Resistenzentwicklung eine entscheidende Rolle.
Die leukämogenen Eigenschaften der FLT3-ITD-TKD-Mutante sind bis jetzt wenig untersucht worden.
In diesem Projekt wollen wir untersuchen:
1) ob FLT3-ITD-TKD wirksamer als FLT3-ITD oder FLT3-TKD ist, um Leukämie zu induzieren.
2) Welcher Tyrosinrest ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Aktivität von FLT3-ITD-TKD?
3) Ob FLT3-ITD-TKD-Doppelmutationen eine genomische Instabilität induzieren.
4) Empfindlichkeit von Leukämiezellen mit FLT3-ITD-TKD gegenüber neuen FLT3-Inhibitoren.
Die beschriebenen Arbeiten sollen helfen, die molekulare Therapie der AML zu verbessern.
veröffentlicht: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8125314/
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20.5
Untersuchung der Rolle von IREB2 in der Akuten Myeloischen Leukämie unter hypoxischen und normoxischen Bedingungen
Dr. med. Sarah Weber, Medizinische Klinik II, Hämatologie und Onkologie, Universitätsklinikum Theodor-Stern-Kai 7,
60590 Frankfurt am Main
Die Akute Myeloische Leukämie
(AML) ist die häufigste Form akuter Leukämien im Erwachsenenalter mit
einer relativen Ü5-Jahres-Überlebensrate von unter 30 %. In den letzten
Jahren konnte zunehmend gezeigt werden, dass AML Blasten von dem sie
umgebenden Mikromilieu erheblich in Ihrer Funktion beeinflusst werden.
So befinden sich AML Blasten in ihren Knochenmarks-Nischen in einem
Zustand pyhsioloischer Hypoxie
(Sauerstoffmangel),
der auch das Therapieansprechen von leukämischen Zellen zu beeinflussen
scheint.
Um mögliche Unterschiede in der Proteinexpression von Zellen unter
physiologischer Hypoxie im Vergleich zur Normoxie aufzudecken,
verglichen wir das Proteom
(Gesamtheit aller Proteine)
von 8 unterschiedlichen AML
Zelllinien, welche mindestens 5 Tage bei 1 % Sauerstoff
(Hypoxie)
bzw. 21 % Sauerstoff
(Normoxie, Idealzustand der
Sauerstoffversorgung)
kultiviert wurden, mittels SILAC/Massenspektro-metrie.
Hierbei fand sich IREB2 in nahezu allen Kulturen hochreguliert.
IREB2 ist
ein RNA-bindendes Protein,
welches sowohl bei Eisenmangel aus auch bei Hypoxie hochreguliert wird
Im Rahmen des Projektes soll der Wirkmechanismus von IREB2 in der AML
weiter aufgeklärt werden.
Dabei soll
1. der Eisengehalt von AML-Zellen mit und ohne IREB2-KO gemessen,
2. die Auswirkungen einer Eisensubstitution/Eisendepletion untersucht,
und
3. die Funktion Eisen-abhängiger intrazellulärer Vorgänge analysiert
werden
Darüber hinaus sollen langfristig Sensibilisatoren und Repressoren für
die Wirkung von IREB2 ausfindig gemacht werden. Auf diese Weise hoffen
wir, molekulare Mechanismen innerhalb von AML Zellen weiter zu
entschlüsseln und neue, möglicherweise Therapie-relevante
Vulnerabilitäten aufzudecken.
Die Fördersumme ermöglicht es, eine studentische Hilfskraft für den
Zeitraum eines Jahres anzustellen.
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20.6
Funktionelle Validierung von genetischen Veränderungen in Knochenmark-Stromazellen von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom (MDS)
Prof. Dr. med. Wolf-Karsten Hofmann, Dr. med. Johann-Christoph Jann, III. Med.Klinik Universiätsmedizin Mannheim, Hämatologie und Onkologie, Theodor-Kutzer-Ufer 1 - 3, 68167 Mannheim
Bei der Untersuchung der Ursachen für das Myelodysplastische Syndrom (MDS) konzentrieren sich die Forschungsaktivitäten seit einigen Jahren nicht nur auf Veränderungen der Blutzellen selbst, sondern auch auf Störungen, die sogenannte „Umgebungszellen“ (das sind Zellen, die den Blutzellen „ein zu Hause“ geben, welches auch als Mikro-Milieu bezeichnet wird) aufweisen. Diese krankhaft veränderten Umgebungszellen können die Blutzellen beim MDS negativ beeinflussen und so dazu beitragen, dass die Blutzellen nicht richtig ausreifen oder gar bösartig entarten – beides Eigenschaften der Blutbildung bei Pateinten mit MDS.
Die Anwendung der Techniken der Genomanalyse werden deshalb in unserer Arbeitsgruppe bereits seit 3 Jahren auch auf die Analyse von Knochenmark-Stromazellen angewendet. Die modernen und aktuelle Entwicklungen auf dem Gebiet der genomischen Sequenzierung erlauben es nun, einzelne Zellen des menschlichen Körpers vollständig genetisch zu untersuchen und damit ein zellspezifisches molekulares Profil zu erstellen. Mit dieser Technik (Single-Cell NGS, Einzel-Zell-Next-Generation-Sequencing) konnte für die „Umgebungszellen“ nachgewiesen werden, dass es eigenständige, von den bisher bekannten genetischen Veränderungen beim MDS abweichende, Störungen im genetischen Code bei diesen Zellen gibt.
Im vorliegenden Projekt werden nun einige der identifizierten genetischen Veränderungen von Knochenmark-Stromazellen detailliert mit verschiedenen molekularen Methoden daraufhin untersucht, ob sie zur Störung der Blutbildung beim MDS beitragen. Ein wichtiges Prinzip der Untersuchungen im Labor ist, daß diese Veränderungen mittels einer modernen Technik (Genschere CRISPR-Cas9) in normale (gesunde) „Umgebungszellen“ eingebracht werden um dann festzustellen, ob sich diese modifizierten Zellen krankhaft verändern. Sollte dies gelingen und nachgewiesen werden, könnten so neue Erkenntnisse über die zu Grunde liegenden Ursachen der Erkrankung gewonnen werden.
Veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41467-021-26424-3s. a. Veröffentl. in Nature ../Veröffentl. Nature (2023) 14, 1497.pdf
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20.7
Unterstütung des Deutschen Registers für Stammuzelltransplantationen DRST
Das Deutsche Register für Stammzelltransplantationen (DRST), gegründet am 3. 4.1998 in Frankfurt am Main, ist zuständig für die zentrale Erfassung und standardisierte Auswertung aller in deutschen Trans-plantationszentren nach dem 01.01.1998 durchgeführten Transplantationen und liefert zeitnah wichtige Daten über durchgeführte Transplantationen bei verschiedenen Indikationen.
Damit stehen den Transplantationszentren wichtige Referenzgrößen zur
Beurteilung, wie auch zur Planung weiterer Aktivitäten und Studien zur
Verfügung. Darüber hinaus unterstützt das DRST die Durchführung von
nationalen und internationalen wissenschaftlichen Studien aktiv.
Es arbeitet eng mit dem europäischen Zentrum (European Group for Blood
and Marrow Transplantation, Maastricht, Niederlande) zusammen.
Dort werden europaweit alle Blutstammzelltransplantationen in
einer Datenbank gespeichert
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2021
21.1
Identifizierung und molekulare Charakterisierung chromosomaler Bruchpunkte bei Patienten
mit Fusionsgen TCF-PBX1 / Translokation t(1:19)(q23:p13) als mögliche Basis für das Monitoring minimaler Resterkrankung
PD Dr. med. rer. nat. Thomas Burmeister, Charité, Campus Virchow-Klinikum, Med. Klinik für Hämatologie, Onkologie u. Tumorimmunologie, Augustenburger Platz 1, 13353 Berlin
Der genetische
Hintergrund der akuten lymphatischen Leukämie ist komplex. In der
Vergangenheit wurden verschiedene Patientengruppen identifiziert, die
sich durch bestimmte Genexpressionsprofile voneinander unterscheiden und
bei denen gewissermaßen bestimmte Signaltransduktionswege gestört sind,
was dann in der Folge auf unterschiedliche Weise zur malignen
Transformation führt. Beispiele hierfür sind die BCR-ABL-positiven
Patienten, die Patienten mit BCR-ABL-like-Genexpressionsprofil (anderen
aktivierten Tyrosinkinasen), die Patienten mit MLL/KMT2A-Fusionsgenen,
etc. Interessant sind diese Untergruppen zum einen deswegen, weil die
molekulare Analyse den Schlüssel zum Verständnis der zugrunde liegenden
Erkrankung liefert, und zum anderen, weil die Patienten häufig klinische
Besonderheiten aufweisen, die eine bestimmte Therapie nahelegen oder
notwendig machen. Beispielsweise definieren die oben genannten Gruppen
sogenannte "Hochrisiko-Gruppen", bei denen eine allogene
Stammzelltransplantation empfohlen wird. Eine andere Patientengruppe
sind die Patienten mit TCF3-PBX1-Fusionsgen, dessen prognostische
Bedeutung bisher nicht eindeutig geklärt ist.
Aus vielen vorangegangenen Arbeiten ist klar geworden, dass die
sogenannte minimale Resterkrankung (MRD) von entscheidender Bedeutung
für den längerfristigen Therapieerfolg ist. Die Messung der minimalen
Resterkrankung geschieht bisher routinemäßig mit der quantitativen
Messung klonal rearrangierter Immungene (Immunglobulingene,
T-Zell-Rezeptor-Gene). Diese Methode hat den Vorteil, dass sie bei
lymphatischen Neoplasien universell anwendbar ist. Sie hat jedoch auch
verschiedene inhärente Nachteile. Zum einen ist sie technisch
verhältnismäßig aufwändig. Die Praxis hat gezeigt, dass es in einem
signifikanten Teil der Fälle nicht gelingt, eine PCR mit hinreichender
Sensitivität zu etablieren.
Der wesentliche Vorteil einer MRD-Diagnostik,
basierend nicht auf rearrangierten Immungenen, sondern basierend auf
Fusionsgenen, ist der, dass hier ein eigentlicher "Krankheitsmarker"
gemonitort wird. Dieser Marker kann während des Krankheitsverlaufs nicht
verloren gehen. Im Falle der Patienten mit TCF3-PBX1-Fusionsgen wäre es
daher wünschenswert, eine auf DNA basierende MRD-Diagnostik für das
Fusionsgen TCF3-PBX1 zur Verfügung zu haben.
Um dies zu bewerkstelligen müssen die jeweiligen Chromosomenbruchpunkte
der Translokation t(1;19)(q23;p13) als die eigentlichen klonalen
molekularen Marker identifiziert werden. Dazu soll eine im Labor des
Antragstellers verfügbare neuartige Sequenzier-technologie
mittels nanopore-Sequencing angewendet werden. Hierbei wird
gewissermaßen ein DNA-Faden durch eine Nanopore eingefädelt und
abgespult und die Sequenz dabei durch die Änderung der elektrischen
Leitfähigkeit gemessen. Da die Bruchpunktregion auf Chromosom 19 relativ
umschrieben ist, lässt sich diese Methode hier effizient anwenden.
Anhand der Chromosomenbruchpunktdaten sollen verschiedene Fragen
beantwortet werden:
• gibt es Chromosomenbruchpunktcluster?
• lassen sich Hinweise auf den
zugrundeliegenden Bruchmechanismus (z. B. RAG/RRS-
vermittelte Bruchereignisse) gewinnen?
• lässt sich der reziproke Bruchpunkt
nachweisen?
Die gewonnenen Daten sollen dann dazu dienen, eine vereinfachte
diagnostische Methode für die MRD-Messung bei Patienten mit TCF3-PBX1
zu entwickeln.
Die Förderung dient der teilweisen Finanzierung einer TA-Stelle.
https://doi.org/10.1038/s41598-023-42294-9
als PDF s41598-023-42294-9.pdf
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21.2
Gezielte genomische Editierung von primären MDS-Zellen und MDS-Zellinien mittels der CRISPR/CAS9-Methodik zur Untersuchung charakteristischer Mutationen in myelodysplastischen Syndromen
Prof. Dr. med. Wolf-Karsten Hofmann, III. Med. Klinik Universitätsmedizin Mannheim, Hämatologie und Onkologie, Theodor-Kutzer-Ufer 1-3, 68167 Mannheim
Myelodysplastische Syndrome (MDS) sind eine Gruppe heterogener maligner Knochenmarkerkrankungen, die durch eine ineffektive, dysplastische Hämatopoese mit peripheren Zytopenien, und einem stark erhöhten Risiko einer Transformation in eine sekundäre akute myeloische Leukämie (AML) gekenn-zeichnet sind. Die exakte Diagnosestellung und Klassifizierung erlaubt eine Einstufung der heterogenen Erkrankung nach Risikoprofil und hat Konsequenz auf Prognose und die Art der Therapie.
Trotz der kontinuierlichen Fortschritte in der Charakterisierung dieser MDS-spezifischen Mutationen durch Methoden wie „Next Generation Sequencing“ ist der mechanistische Zusammenhang zwischen genomischen Veränderungen und Krankheitsbild weitgehend ungeklärt.
Die CRISPR-Cas9-Methode ist eine molekularbiologische Technik mit der sich DNA gezielt schneiden und beliebig verändern lässt (sogenannte Genschere). Im Kontext der hämato-onkologischen Forschung können hiermit einerseits Zelllinien erzeugt werden, die charakteristische Mutationen aufweisen, welche mit denen der betroffenen Patienten identisch sind, andererseits auch primäre Zellen genetisch beliebig verändert werden. Das Potential dieser nobelpreisgekrönten Technik ist hierbei noch längst nicht ausgeschöpft und die Bandbreite der Anwendungsmöglichkeiten befindet sich in einem kontinuierlichen Wachstum.
Unserer Arbeitsgruppe ist es 2020 mit der o. g. Genschere gelungen, eine leukämische Zelllinie zu generieren, die eine MDS-typische Mutation (SF3B1) beherbergt. Mithilfe dieser Zelllinie konnten bereits Experimente zur Untersuchung neuer Wirkstoffe begonnen werden, die diese Mutation als therapeutisches Ziel anvisieren.
Für die langfristige und planbare Durchführung von CRISPR-Cas9-Experimenten mit Zelllinien und MDS-Primärzellen ist ein leistungsstarkes und flexibles Transfektionsgerät notwendig, um die Komponenten in die Zellen bzw. den Zellkern zu transportieren. Besonders bei schwer zu transfizierenden Zellen wie z. B. Blutstammzellen ist die Elektroporation die bevorzugte Methode und wird auch in der überwiegenden Mehrheit aktueller Publikationen als Transfektionsmethode bei CRISPR-Cas9 angewandt.
Nach objektiver Betrachtung der aktuell verfügbaren Elektroporationsgeräte stellt sich das Neon Transfektionssystem von Thermo Fisher Scientific als die beste Option für unsere Bedürfnisse dar. Hier kann neben einem geringeren Transfektionsvolumen von 10 μl auch eine individuelle Anpassung der Transfektionsparameter vorgenommen werden. Dies ist für uns wichtig da wir mit verschiedenen Zelltypen und –linien arbeiten die je eigens angepasste Elektroporationsbedingungen benötigen.
Die aktuelle und zukünftige Bearbeitung von hoch-kompetitiven Forschungsprojekten im Bereich der MDS-Forschung erfordert die permanente, stabile Etablierung des CRISPR-Cas9-Systems in unserem wissenschaftlichen Labor.
Die Förderung dient der Anschaffung eines „Neon Transfektionssystem von Thermo Fisher Scientific“ sowie der Erstausstattung mit erforderlichen Verbrauchsmitteln.
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21.3
Genetische Analyse von Knochenmark-Stromazellen von Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS) auf Einzel-Zell-Niveau
Prof. Dr. med. Wolf-Karsten Hofmann und Prof. Dr. med. Daniel Nowak, III. Medizinische Klinik Hämatologie
und Onkologie, Universitätsmedizin, Theodor-Kutzer-Ufer 1 – 3. 68167 Mannheim
Die Untersuchung von genetischen Veränderungen hat in den letzten Jahren sehr stark dazu beigetragen, dass bösartige Bluterkrankungen immer besser diagnostiziert und inzwischen mit verschiedenen Medikamenten erfolgreich behandelt werden können. Um diese Erfolge weiter ausbauen zu können, ist es zunehmend erforderlich, die Ursachen der Erkrankung – die in mehr als 90 % der Fälle nicht bekannt sind – zu untersuchen.
Die Anwendung der Techniken des DNA-Sequenzierens war bisher auf die Analyse von sogenannten „Zellgruppen“ (also mehrere tausend Zellen aus dem Blut oder dem Knochenmark) beschränkt. Das hatte insbesondere technische Gründe (Menge des zur Verfügung stehenden Zellmaterials). Sehr moderne und aktuelle Entwicklungen auf dem Gebiet der genomischen Sequenzierung erlauben es nun, einzelne Zellen des menschlichen Körpers vollständig genetisch zu untersuchen und damit ein zellspezifisches molekulares Profil zu erstellen. Diese Technik (Single-Cell NGS, Einzel-Zell-Next-Generation-Sequencing) wird die molekulare Diagnostik und den Erkenntnisgewinn über Krankheiten der Blutbildung revolutionieren, da es damit möglich sein wird, einzelne krankheitsspezifische (Tumor-) Zellen genau zu charakterisieren. Bei hämatologischen Erkrankungen könnte so ein neuer Meilenstein bei der Unter-suchung der Pathophysiologie und Mechanismen dieser bösartigen Veränderungen entstehen.
Im vorliegenden Projekt soll diese innovative und bahnbrechende Technik auf die Analyse von einzelnen Knochenmarkzellen von Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS) angewandt werden, um weitere Erkenntnisse über die zu Grunde liegenden Ursachen der Erkrankung zu gewinnen.
Es handelt sich um eine weitere Förderung des
Projektes aus 2019
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21.4
Unterstützung des Deutschen Registers für
Stammzelltransplantation DRST
Das Deutsche Register für
Stammzelltransplantationen (DRST), gegründet am 3. 4.1998 in Frankfurt
am Main, ist zuständig für die zentrale Erfassung und standardisierte
Auswertung aller in deutschen Transplantationszentren nach dem
01.01.1998 durchgeführten Transplantationen und liefert zeitnah wichtige
Daten über durchgeführte Transplantationen bei verschiedenen
Indikationen.
Damit stehen den Transplantationszentren wichtige Referenzgrößen zur
Beurteilung, wie auch zur Planung weiterer Aktivitäten und Studien zur
Verfügung. Darüber hinaus unterstützt das DRST die Durchführung von
nationalen und internationalen wissenschaftlichen Studien aktiv.
Es arbeitet eng mit dem europäischen Zentrum (European Group for Blood
and Marrow Transplantation, Maastricht, Niederlande) zusammen.
Dort werden europaweit alle Blutstammzelltransplantationen in
einer Datenbank gespeichert
22.1
Funktionelle
Validierung von genetischen Veränderungen in Knochenmark-
Stromazellen
von Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS)
Prof. Dr. med. Wolf-Karsten
Hofmann,
Prof. Dr. med. Daniel Nowak,
III.
Medizinische Klinik Hämatologie und Onkologie
Universitätsmedizin, Theodor-Kutzer-Ufer 1 – 3. 68167 Mannheim
Es handelt sich um eine weitere Förderung des Projektes aus 2021/3
I
n den letzten Jahren hat sich die grundlegende Hypothese, dass das MDS nicht eine isolierte Erkrankung der hämatopoetischen Stammzellen ist, sondern auch auf eine deregulierte Funktion der Knochenmark-nische zurückzuführen ist, etabliert.Molekulare Untersuchungen mittels next generation sequencing (NGS) haben gezeigt, dass MDS-Zellen im Knochenmark in den meisten Fällen mehrere erworbene molekulare Läsionen, wie Punktmutationen und chromosomale Veränderungen (Deletionen, Uniparentale Disomie, Translokationen) tragen. Diese Beobachtung hat zuletzt die Fragen aufgeworfen, ob diese multiplen Veränderungen gleichzeitig in einem dominierenden Klon vorkommen, oder ob mehrere Klone mit z.T. unterschiedlichen molekularen Läsionen nebeneinander existieren und welcher klonalen Evolution diese Klone unterliegen. Dahingehend haben mehrere Arbeiten gezeigt, dass beide Fälle für MDS zutreffen können.
Um erfolgreich und tiefer in die zugrunde liegenden Mechanismen beim MDS einzudringen und gleichzeitig die Bedeutung der sogenannten „Stroma-Zellen“ (das sind Bindegewebs-Zellen, die für die Ernährung und das Überleben der Blutstammzellen außerordentlich wichtig sind) zu untersuchen, kann die seit kurzem verfügbare Technik des „Einzelzell-NGS“ (hier werden von einzelnen, ausgewählten Zellen mit modernster Sequenziertechnik komplette genetische Profile erstellt) eingesetzt werden. Als weltweit erste Gruppe konnten wir diese Technik auf Stroma-Zellen bei MDS-Patienten anwenden. Ergebnisse einer ersten systematischen Analyse von Einzel-Zellen zeigen genetische Defekte, die offensichtlich in Zusammenhang mit der Krankheitsentstehung zu sehen sind. Diese Daten wurden Ende 2021 in Nature Communications publiziert.
Nach Definition der genetischen Veränderungen sollen nun im Anschluß funktionelle Analyse dieser krankheitsspezifischen Veränderungen genauer charakterisieren, um später prüfen zu können, ob sich bei den gestörten Stoffwechselwegen neue Therapieformen für Patienten mit MDS anwenden bzw. entwickeln lassen.
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22.2
Die
Interferenz von klonaler Hämatopoese und CAR-T-Zelltherapie: Eine
Analyse der wechselseitigen Effekte
Prof. Dr. med. Frederik Damm,
Dr. med. Johanna Kerschbaum, Charité - Universitätsmedizin Berlin,
Campus
Virchow-Klinikum (Molekulares Krebsforschungszentrum) Medizinische
Klinik mit Schwerpunkt Hämatologie,
Onkologie und Tumorimmunologie,
Labor Berlin – Charité Vivantes,
Augustenburger Platz 1,
13353 Berlin
Als klonale Hämatopoese bezeichnet man
einen prämalignen Zustand, der durch das Vorkommen von
Leukämie-assoziierten Mutationen im Blut gesunder Individuen definiert
ist. Dieses Phänomen tritt altersabhängig in mindestens 20-30% der
älteren Bevölkerung auf und ist mit einem erhöhten Risiko für
hämatologische Neoplasien und einer erhöhten allgemeinen Sterblichkeit
verbunden. Stressfaktoren wie chronische Entzündungen oder Schadstoffe
können die Expansion der mutierten Blutstammzellen auf verschiedene Art
und Weise erheblich beeinflussen. Auch Behandlungsverfahren wie Chemo-
oder Strahlentherapie bedingen den Auswuchs dieser prämalignen Klone.
Seit wenigen
Jahren haben zelluläre Therapieverfahren wie die CAR T-Zelltherapie
unser Behandlungs-spektrum für Patient*innen mit B-Zell Lymphomen
erheblich erweitert. Auch wenn die Behandlungserfolge beeindruckend und
nachhaltig sind, bleiben viele Fragen, wie anhaltende Zytopenien oder
überschießende Entzündungsreaktionen unverstanden. In diesem Projekt
möchten wir daher, die wechselseitigen Effekte der klonalen Hämatopoese
und einer CAR T-Zelltherapie systematisch untersuchen.
Veröffentllicht:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10550045/
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22/3
Etablierung eines Ex-Vivo/In-Vitro Organoidsystems für die
Untersuchung der Pathogenese des Myelodysplastischen Syndroms
(Co-Finanzierung eines
Fluoreszenzmikroskopes Keyence BZ-X810)
Prof. Dr. med. Wolf-Karsten
Hofmann III. Medizinische Klinik Hämatologie und Onkologie,
Universitätsmedizin, Theodor-Kutzer-Ufer 1 – 3.
68167 Mannheim
Projektbezogene Förderung der
Anschaffung eines Gerätes
Seit 2009 können wir in Mannheim
auf verschiedene Erfolge bei der Untersuchung der Ursachen von und bei
der Entwicklung neuer diagnostischer Verfahren und therapeutischer
Methoden bei Myelodysplastischen Syndromen (MDS) verweisen.
Weltweit wurde in Mannheim das erste MDS-Maus-Modell entwickelt, bei dem
eine Co-Transplantation von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen zusammen
mit autologen Knochenmarkstromazellen (MSCs) der gleichen Patienten eine
langfristige und effiziente Etablierung von MDS in immundefizienten NSG
Mäusen ermöglicht.
In unserer Arbeitsgruppe wird eine stetige Verbesserung unserer
experimentellen Systeme und Modelle angestrebt und aus ethischen Gründen
ist ein Ziel unserer Arbeitsgruppe, Tierversuche möglichst zu ersetzen
oder zu vermindern.
So haben wir bereits vor einigen Jahren mit der zielstrebigen
Entwicklung von sogenannten „Ersatz-Organ-Modellen“ (Organoide)
begonnen. Dabei handelt es sich um „kleine Bioreaktoren“, die im
Laborglas die Simulation der Verhältnisse im Knochenmark von
MDS-Patienten erlauben und direkte wissenschaftliche Untersuchungen
außerhalb eines Mausmodells ermöglichen. Damit sind wir erneut auf dem
Weg, in unserem Labor ein einzigartiges und effektives Modell beim MDS
zu entwickeln, um zum einen die Pathogenese dieser Erkrankung weiter zu
untersuchen und Defekte in der Blutbildung zu beschreiben.
Die Anschaffung des o. g. Gerätes
wird ermöglichen, unser dreidimensionales Modell der hämatopoeti-schen
Knochenmarknische
täglich mikroskopisch im
eigenen wissenschaftlichen Labor zu analysieren.
Die zukünftige Bearbeitung von hoch-kompetitiven Projekten im Bereich
der MDS-Forschung wird wesentlich von der Nutzbarkeit des Mikroskopes
abhängen.
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22/4
Multiplexe Charakterisierung der Organisation des Knochenmarks bei
Patienten mit akuter Myeloischer Leukämie
Dr. rer nat, Msc Konstantinos D.
Kokkaliaris, Nachwuchsgruppenleiter Quantitative räumliche
Krebsbiologie,
Universitätsklinikum Frankfurt & Goethe-Universität Frankfurt, Dr.
Senckenberg Institut für Pathologie, Theodor-Stern-Kai 7, 60596,
Frankfurt am Main
Die akute
myeloische Leukämie (AML) ist eine verheerende tödliche Krankheit mit
ungünstiger Prognose. Mehr als 70 % der AML-Patienten versterben
innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose, wobei insbesondere ältere
Menschen eine ungünstigere Prognose haben. Trotz kontinuierlicher
Fortschritte bei der Charakterisierung des genetischen und
epigenetischen Profils von AML-Zellen ist unser Verständnis ihrer
räumlichen Zusammenhänge mit Knochenmarkspopulationen nach wie vor
begrenzt. Dies ist vor allem auf die immense Komplexität der
Mikroumgebung des Knochenmarks (KM) zurückzuführen, die sich aus
verschiedenen hämatopoetischen Zelltypen und nicht-hämatopoetischen
Komponenten zusammensetzt (vaskuläre, osteolineage, neuronale,
mesenchymale Zellen, extrazelluläre Matrixproteine). Mit dem
vorgeschlagenen Projekt wollen wir eine Multiplex-Gewebebildgebung an
menschlichen KM-Biopsien entwickeln und die KM-Organisation von
AML-Patienten verschiedener Altersgruppen quantifizieren. Unsere
Ergebnisse werden für das Verständnis der räumlichen KMs-Organisation
menschlicher AML-Patienten von Bedeutung sein und könnten in Zukunft zur
Auswahl der wirksamsten Therapieschemata beitragen.
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22/5
Unterstützung
des Deutschen Registers für Stammzelltransplantationen DRST
Das Deutsche Register für
Stammzelltransplantationen (DRST), gegründet am 3. 4.1998 in Frankfurt
am Main, ist zuständig für die zentrale Erfassung und standardisierte
Auswertung aller in deutschen Transplantationszentren nach dem
01.01.1998 durchgeführten Transplantationen und liefert zeitnah wichtige
Daten über durchgeführte Transplantationen bei verschiedenen
Indikationen.
Damit stehen den Transplantationszentren wichtige Referenzgrößen zur
Beurteilung, wie auch zur Planung weiterer Aktivitäten und Studien zur
Verfügung. Darüber hinaus unterstützt das DRST die Durchführung von
nationalen und internationalen wissenschaftlichen Studien aktiv.
Es arbeitet eng mit dem europäischen Zentrum (European Group for Blood
and Marrow Transplantation, Maastricht, Niederlande) zusammen.
Dort werden europaweit alle Blutstammzelltransplantationen in
einer Datenbank gespeichert
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23/1
Funktionelle genomische Untersuchung
zur Hemmung des LYSYL-Oxidase-Signalweges bei Patienten mit
Myelodysplastischer Neoplasie (MDS)
Prof.
Dr. med. Wolf-Karsten Hofmann,
Dr. med. Alexander Streuer,
III.
Medizinische Klinik Hämatologie und Onkologie
Universitätsmedizin, Theodor-Kutzer-Ufer 1 – 3. 68167
Mannheim
Myelodysplastische Neoplasien (MDS) stellen eine heterogene Gruppe von
Erkrankungen dar, die durch eine eingeschränkte Hämatopoese und
dysplastische Veränderungen im Knockenmark charaterisiert sind. Es
handelt sich um eine Erkrankung vorwiegend der älteren Bevölkerung.
Als einzige kurative Behandlungsmöglichkeit steht die allogene
Stammzelltransplantation zur Verfügung, die trotz vielfältiger
Weiterentwicklung für Patienten über 70 nur selten anwendbar ist. Somit
ist für Hochrisiko-Patienten nur mit Azacitidin (AZA) eine wirksame
Therapie zur Verlängerung des Gesamt-überlebens verfügbar. Obwohll AZA
bei 50 % der Patienten hämatologisch eine hämatopoetische Verbesserung
erreicht, hat es nur geringen Einfluss, die Krankheit aufzuhalten und
ein Fortschreiten ist hochwarscheinlich. Zusätzlich besteht häufig eine
Anämie mit hohem Transfusionsbedarf, welche die Lebensqualität chronisch
erkrankter Patienten stark einschränken kann.
In den letzten Jahren gewannen die nicht an der Blutbildung beteiligten
Zellen der Knochenmarksnische bei der Entstehung der Myelodysplastischen
Syndrome immer mehr an Bedeutung. Krankhafte Interaktionen zwischen
blutbildenden Zellen und Vorläuferzellen verschiedener Zelltypen tragen
zu Entwicklung und Fortschreiten von MDS bei.
Die Gruppe der Lysyloxidase (LOX) sind Enzyme, die über oxidativen Abbau
von Aminosäuren eine Quervernetzung von Kollagen ermöglichen und somit
die Basis für die mechanischen Eigenschaften der
extrazellulären Matrix
(Die
extrazelluläre Matrix
(EZM)
oder Interzellularsubstanz ist der Teil des Gewebes, der zwischen den
Zellen liegt und sie geflechtartig umgibt. Die EZM füllt die
Zwischenräume der Zellen aus und vermittelt so den Kontakt zwischen
ihnen.).
Durch vermehrte Produktion von LOX
können in Zellwucherungen diese Eigenschaften verändert sein.
Unsere jüngsten Daten zeigen, dass der pan-LOX/LOXL-Inhibitor PXS-5505
verstärkte Wirkung mit AZA aufweist und das Therapieansprechen deutlich
verbessert, die Blutbildung anregt und Eigenschaften einer
gesunden Knochenmarknische wiederherstellt.
Die genauen Mechanismen, die dem
Ansprechen der Kombinationsbehandlung PXS-5505 und AZA (P+A) bei MDS
zugrunde liegen, sowie die, die blutbildende Stimulierung dieser
Kombination bei der direkten Anwendung im Patienten, müssen noch geklärt
werden.
Dazu wird eine multrizentrische Studie der Phase Ib/II zur Evaluation
der Sicherheit und Effektivität von
(P+A) bei Patienten mit MDS mit der Medizinischen Fakultät Mannheim als
federführendes Zentrum eingeleitet. Um die Mechanismen dieser Therapie
weiter zu erforschen, ist parallel dazu eines wissenschaftliches
Begleit-Programm geplant.
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23/2
Klonale Hämatopoese und myeloische
Malignome nach Behandlung mit PARP-Inhibition
Prof. Dr. med. Frederik Damm,
Charité, Campus Virchow, Abteilung Hämatologie, Onkologie,
Tumorimmunologie,
Augustenburger Platz 1, 13353 Berlin
Behandlungsbedingte myeloische Neoplasmen (t-MN) sind eine Gruppe von
lebensbedrohlichen Zweitkrebserkrankungen, die auf eine vorangegangene
Strahlen- und Chemotherapie bei einer primären bösartigen Erkrankung
zurückzuführen sind. Sie treten typischerweise in Form eines
myelodysplastischen Syndroms (MDS) oder einer akuten myeloischen
Leukämie (AML) auf und zeichnen sich durch eine große Anzahl genetischer
Aberrationen aus, die bekanntermaßen eine schlechte Prognose zur Folge
haben.
In jüngster Zeit wurde bei Patienten, die mit
Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren (PARPi) behandelt wurden,
durchweg über eine erhöhte relative Inzidenz von t-MNs berichtet. Diese
neuartigen Medikamente haben eine hohe Wirksamkeit bei der
Krebsbekämpfung gezeigt, insbesondere in Fällen, in denen die
DNA-Schadensbehebungswege beeinträchtigt sind. Heutzutage gehören PARPi
zu den Standardbehandlungs-algorithmen für Patienten mit Eierstock-,
Prostata-, Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Wir wollen herausfinden, wie die Mutationsmuster, die wir bei den
profilierten Patienten finden, das Verhalten der menschlichen
hämatopoetischen Vorläuferzellen beeinflussen und den Zellen eine
erhöhte Selbsterneuerungskapazität verleihen, die zur Entwicklung einer
t-MN führt. Wir werden in der Lage sein, diese Muster mit den in der
Studie berichteten Ergebnissen (d. h. krankheitsfreies Überleben und
andere klinische Korrelate) zu korrelieren.
Insgesamt wollen wir die Mechanismen
entschlüsseln, die mit der klonalen Expansion von CH-Klonen
während der Behandlung mit PARPi verbunden sind. Diese Experimente
werden neue Interventions-möglichkeiten eröffnen, um die bedauerliche
Nebenwirkung der t-MN-Entwicklung nach einer PARPi-Behandlung zu
verhindern.
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23/3
Unterstützung des Deutschen
Registers für Stammzelltransplantationen DRST
Das Deutsche Register für Stammzelltransplantationen (DRST), gegründet
am 3. 4.1998 in Frankfurt
am Main, ist zuständig für die zentrale Erfassung und standardisierte
Auswertung aller in deutschen
Transplantationszentren nach dem
01.01.1998 durchgeführten Transplantationen und liefert zeitnah wichtige
Daten über durchgeführte Transplantationen bei verschiedenen
Indikationen.
Damit stehen den Transplantationszentren wichtige Referenzgrößen zur
Beurteilung, wie auch zur Planung weiterer Aktivitäten und Studien zur
Verfügung. Darüber hinaus unterstützt das DRST die Durchführung von
nationalen und internationalen wissenschaftlichen Studien aktiv.
Es arbeitet eng mit dem europäischen Zentrum (European Group for Blood
and Marrow Transplantation, Maastricht, Niederlande) zusammen.
Dort werden europaweit alle Blutstammzelltransplantationen in einer
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